一、实验原理

1. 细胞在不同周期（G0/G1、S、G2/M）的 DNA 总量不同

• G0/G1：二倍体，DNA 含量为 2N

• S 期：DNA 复制，含量介于 2N～4N

• G2/M 期：DNA 已复制完成，含量为 4N

2. 使用 DNA 荧光染料（PI、DAPI、7-AAD 等）对 DNA 定量染色

3. 流式细胞仪检测荧光强度 → 拟合出各周期细胞比例

• 嵌入 DNA 双链，荧光强度与 DNA 含量成正比

• 需用 RNase A 去除 RNA，避免干扰

二、所需试剂

• 70% 乙醇（固定）

• PBS

• RNase A（去除 RNA）

• PI 染色液

• 含血清培养基、胰酶

三、标准实验步骤（贴壁细胞通用）

1. 细胞处理与收集

1. 细胞给药 / 处理后，弃培养基

2. 胰酶消化，含血清培养基终止消化

3. 转入离心管，1000 rpm 离心 5 min，弃上清

4. PBS 重悬洗涤一次，再次离心弃上清

关键：必须单细胞悬液，不能有团块，否则周期图畸形。

2. 固定（4℃过夜标准）

1. 用 预冷 PBS 轻轻重悬细胞

2. 缓慢逐滴加入 -20℃预冷 70% 乙醇，边加边混匀

3. 4℃固定 ≥4 h 或过夜

3. 洗涤去乙醇

1. 离心弃乙醇固定液

2. PBS 洗 1～2 次，离心弃上清

4. RNase 消化（必须！）

1. 加入 RNase A 工作液

2. 37℃水浴 30 min

   作用：降解 RNA，避免 PI 与 RNA 结合造成假高荧光

5. PI 染色

1. 加入 PI 染液（终浓度 50 μg/mL 左右）

2. 避光 室温染色 15–30 min

3. 300 目滤网过滤后上机检测

四、上机与分析

1. 激发：488 nm 激光

2. 接收：FL2 通道（PI 红色荧光）

3. 用 ModFit / FlowJo 进行周期拟合

   输出指标：

• G0/G1 期比例

• S 期比例（DNA 合成活跃）

• G2/M 期比例

• Sub-G1 期（凋亡细胞，DNA 碎片 <2N）

五、结果解释

• G0/G1 升高：细胞阻滞在 G1 期，增殖减慢

• S 期降低：DNA 合成受抑制

• G2/M 升高：细胞阻滞在分裂期

• Sub-G1 峰明显：凋亡细胞增多