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软琼脂实验

产品简介

软琼脂实验是细胞实验中不常见实验之一，通常由从事细胞实验多年的实验人员进行操作，通过的实验操作，以实验结果的性。

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更新时间：2026-03-20
厂商性质：代理商
访问量：1506
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步：配制琼脂

  1. 配制底层琼脂：


    • 用基础培养基（如DMEM）配制1%-1.2%的高熔点琼脂糖溶液，加热煮沸使其全融化，随后置于42-45°C水浴中恒温冷却，防止凝固。


    • 将等体积的2×全培养基（含2×浓度的血清和双抗）预热至相同温度。


    • 将两者等体积混合，得到终浓度为0.5%-0.6%的底层琼脂工作液。


  2. 配制上层琼脂：


    • 方法同上，但使用浓度更低的琼脂糖（通常0.3%-0.4%）。


第二步：辅制底层胶

  • 将温热的底层琼脂工作液迅速加入6孔板中（每孔约1-1.5 mL），轻轻摇晃确保铺平。


  • 室温静置10-15分钟，使其全凝固。凝固后的底层胶为细胞提供支撑，并防止其贴壁。


第三步：制备细胞悬液与辅制上层胶

  1. 制备细胞悬液：用全培养基重悬待测细胞，计数。细胞浓度是关键，通常每孔接种1000-10000个细胞，具体取决于细胞成克隆能力。


  2. 混合：将预热的上层琼脂工作液与含有细胞的培养基等体积混合，确保细胞均匀分布，形成终浓度为0.15%-0.2%的含细胞上层琼脂混合液。


  3. 辅上层胶：立即将1-1.5 mL混合液轻柔地加在已凝固的底层胶上，注意不要破坏底层胶。轻轻晃动铺平。


  4. 凝固：室温下静置10-15分钟，使其全凝固。


第四步：培养与观察

  1. 添加培养基：待上层胶凝固后，沿孔壁缓慢加入1-2 mL预热的新鲜全培养基，覆盖胶的表面，以防止琼脂干燥，并为细胞提供营养。注意不要冲散上层胶。


  2. 培养：将培养板置于37°C， 5% CO₂ 培养箱中培养。


  3. 换液：每隔2-3天，小心吸去旧培养基，沿孔壁缓慢加入新鲜培养基。此步骤需格外小心，避免破坏软胶。


  4. 观察：培养1-3周后，在倒置显微镜下观察克隆形成情况。恶性程度高、增殖快的细胞通常1-2周即可见明显克隆。


第五步：染色、计数与分析

  1. 染色：通常使用结晶紫、MTT或INT等染料进行活细胞染色，使克隆更易观察和计数。


    • 结晶紫法：吸去培养基，加入固定液（如甲醇）固定，再加入结晶紫染色液染色，用PBS或水清洗。


  2. 计数与分析：


    • 手动计数：在显微镜下，计数直径大于50-100 μm（或细胞数>50个）的克隆。通常使用低倍镜（4×或10×物镜）扫描整个孔。


    • 软件分析：可使用ImageJ等图像分析软件，对整孔图像进行自动克隆识别和计数。


    • 报告结果：通常以克隆形成率表示：(克隆数 / 接种细胞数) × 100%。或直接比较不同处理组之间的克隆数量和大小。





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