流式细胞术实验

主要组成部分与工作流程

• 这是实验成败的关键。需要制备出细胞分散良好、无团块、活性高的单细胞悬液。

  
  

• 来源：培养的细胞系、血液、骨髓、淋巴结、脾脏、实体瘤组织等。

  
  

• 对实体组织，常需酶消化（如胶原酶、胰酶）和机械分散。

  
  

• 这是实现“多参数"分析的基础。抗体特异性结合细胞表面或内部的靶蛋白。

  
  

• 直接染色：使用偶联了荧光染料的抗体直接标记。

  
  

• 间接染色：使用未标记的一抗，再用荧光标记的二抗进行检测（较少用，易增加非特异性背景）。

  
  

• 胞内染色：如需检测细胞因子、磷酸化蛋白等，需先固定和破膜。

  
  

• 激光照射：一束或多束不同波长的激光（如488nm蓝激光， 405nm紫激光， 640nm红激光）照射细胞。

  
  

• 信号检测：细胞被激发后产生多种信号，被不同的探测器接收：

  
  

• 前向散射：反映细胞的相对大小。

  
  

• 侧向散射：反映细胞的内部颗粒度和复杂性。

  
  

• 散射光信号：

  
  

• 荧光信号：荧光染料被激发后发射的特定波长荧光，反映目标分子的表达水平。每个荧光通道对应一种标记物。

  
  

• 设门：这是核心分析策略。在一张二维点图或等高线图上，根据细胞的一个或多个参数，圈定出感兴趣的细胞亚群。常见策略：

  
  

• 用FSC-A/SSC-A 门排除碎片和死细胞，圈出活细胞。

  
  

• 用FSC-H/FSC-A 或SSC-H/SSC-A 门排除粘连细胞，得到单细胞。

  
  

• 再用荧光标记进一步区分不同细胞亚群（如CD3+ T细胞， CD4+ 辅助T细胞， CD8+ 杀伤T细胞）。