Transwell细胞实验检测

Transwell细胞实验是一种广泛应用于研究细胞迁移、侵袭、趋化及共培养的体外检测方法，其核心原理是通过聚碳酸酯膜分隔上下培养室，模拟体内微环境以观察细胞行为。以下是基于证据的综合解析：

一、实验原理

1. 基本结构：Transwell小室由上下两室组成，中间以通透性膜（孔径通常为0.8-12 μm）隔开。下层培养液中的趋化因子或血清等成分可穿过膜，诱导上室细胞迁移或侵袭。

2. 迁移与侵袭的区别：

• 迁移实验：仅需细胞穿透聚碳酸酯膜，无需额外基质胶，适用于检测运动能力。

• 侵袭实验：需在膜上预铺Matrigel基质胶（模拟细胞外基质），细胞需分泌蛋白酶（如MMPs）降解基质胶后才能穿过，用于评估侵袭潜能。

二、实验步骤（以侵袭实验为例）

1. 基质胶铺板：

• 预冷枪头及培养板，将Matrigel稀释后（常用1:8~1:10）加入Transwell上室底部，4℃凝固5小时或37℃聚合30分钟，形成基质胶层。

2. 细胞准备：

• 消化细胞后离心（如800 r/min，5分钟），调整密度为1×10⁵~1×10⁶个/mL，用无血清培养基重悬。

3. 接种与培养：

• 上室加入细胞悬液（100-200 μL），下室加入含趋化因子（如30%胎牛血清）的培养基（500-600 μL），37℃孵育8-24小时（时间因细胞类型而异）。

4. 固定与染色：

• 用棉签擦除未穿透膜的细胞，多聚甲醛或75%乙醇固定，结晶紫或苏木精染色，显微镜下计数下室细胞。

5. 结果分析：

• 选取5个随机视野计数，通过穿膜细胞数或荧光强度（如ECM554试剂盒）定量分析。

三、关键影响因素与注意事项

1. 细胞状态：

• 需确保细胞活力，饥饿处理（无血清培养基）可减少背景干扰。

• 细胞密度过高会导致穿膜过快，难以计数；过低则可能无统计学差异。

2. 实验条件：

• 孔径选择：迁移实验常用8-12 μm，侵袭实验需结合基质胶厚度调整。

• 血清浓度：下室血清浓度需高于上室以形成趋化梯度，但过高可能加速细胞死亡。

• 避免气泡：加液时需缓慢，防止气泡阻隔细胞运动。

3. 基质胶处理：

• Matrigel需4℃解冻，稀释后快速铺板以防凝固不均。

• 不同批次Matrigel需预实验优化浓度。

四、应用场景

1. 肿瘤研究：检测基因沉默（如LKB1）、过表达（如IncRNA-p21）或药物处理（如SP600125）对肿瘤细胞侵袭迁移的影响。

2. 信号通路研究：结合Western Blot分析E-cadherin、MMPs等蛋白表达，探究EMT等机制。

3. 药物筛选：评估化合物对细胞迁移/侵袭的抑制或促进作用。

五、常见问题与解决方案

1. 细胞不穿膜：

• 可能原因：细胞无侵袭能力、饥饿时间不足、上室混入血清、孔径不匹配。

• 对策：验证细胞特性、延长饥饿时间、优化孔径。

2. 结果重复性差：

• 统一细胞计数方法，避免分组间操作差异；使用同一批次试剂。