ROS活性氧检测技术实验

活性氧（ROS）检测技术实验是通过多种方法测量细胞内或组织内ROS水平的关键手段，其核心原理基于ROS与特定探针的氧化反应生成可检测信号。以下是详细的实验方法及注意事项：

一、常用检测方法

1. 荧光探针法（DCFH-DA法）

• 原理：DCFH-DA穿透细胞膜后，被细胞内酯酶水解为无荧光的DCFH，后者被ROS氧化生成绿色荧光的DCF。荧光强度与ROS水平成正比。

• 仪器：流式细胞仪、荧光显微镜、荧光分光光度计或荧光酶标仪。

• 激发/发射波长：不同试剂盒参数略有差异，常见激发波长488-502 nm，发射波长525-530 nm。

2. 组织及液体样本检测

• 组织样本：使用008 ROS探针（红色荧光，激发/发射波长510/610 nm），需优先使用新鲜组织，冻存样本可能导致ROS损失。

• 液体样本：采用BBoxiProbe® O11探针（绿色荧光，激发/发射波长488/516 nm），适用于细胞培养基等液体环境。

3. 线粒体特异性检测

• 使用高内涵仪器结合化合物（如鱼藤酮）干预线粒体功能，或采用MitoSOX Red探针（红色荧光）靶向线粒体超氧化物。

4. 其他方法

• 电子顺磁共振（EPR） ：检测O₂⁻、·OH等自由基，需结合自旋捕获技术。

• 化学发光法：利用Lucigenin等探针检测超氧化物，无需激发光源。

二、实验步骤（以DCFH-DA法为例）

1. 样本准备

• 细胞类型：贴壁或悬浮细胞需调整探针装载方式。贴壁细胞建议检测时汇合度达50-70%。

• 组织样本：优先使用新鲜组织，冻存样本需验证ROS残留量。

2. 探针装载

• 浓度：DCFH-DA工作液通常为5-20 μM（按1:250至1:1000稀释母液）。

• 孵育条件：37℃避光孵育20-40分钟，悬浮细胞需后续洗涤去除未进入探针。

• 顺序调整：

• 短刺激（<4小时）：先装载探针，后处理细胞。

• 长刺激（>4小时）：先处理细胞，后装载探针。

3. 检测与参数设置

• 仪器选择：根据样本量选择荧光酶标仪（高通量）或共聚焦显微镜（亚细胞定位）。

• 阳性对照：使用Rosup（50-100 mM）验证实验有效性。

4. 数据分析

• 荧光强度通过软件（如ImageJ）量化，对比处理组与对照组的差异。

三、注意事项

1. 样本处理

• 避免反复冻融，尤其是组织样本，否则ROS易降解。

• 检测前用无血清培养基或PBS清洗细胞，减少背景干扰。

2. 实验条件控制

• 温度：光照实验需控制温度在20-29℃，避免温度波动影响ROS生成。

• 避光操作：探针及样本需全程避光，防止荧光淬灭。

3. 探针优化

• 根据细胞类型调整探针浓度，避免浓度过高导致毒性或背景信号。

• 缩短探针装载后至检测的时间（建议<1小时），减少假阳性。

4. 质量控制

• 设置无探针对照组、阳性对照组（Rosup）及空白组，排除自发荧光影响。

四、应用场景

• 疾病机制研究：如氧化应激与神经退行性疾病、癌症的关系。

• 药物评价：通过ROS水平变化评估药物抗氧化效果。

• 环境毒理学：检测污染物（如紫外线、化学物质）诱导的ROS累积。