单细胞转录组测序

单细胞转录组测序简介：10x Genomics 是基于微流控技术的单细胞系统，可同时获得100-800000个细胞的表达信息，实现对细胞群体的划分与细胞群体间基因表达差异的检测，是肿瘤细胞异质性、免疫细胞群体检测以及胚胎发育研究的黄金方法。10xGenomics单细胞应用广泛，可应用的细胞类型有：生殖细胞，胚胎细胞，神经细胞，免疫细胞，肿瘤细胞，干细胞，其他原代细胞。

1  单细胞转录组测序实验流程

1.1实验流程图

1.2实验描述

1) 细胞质检RNA，用Countess®II Automated Cell Counter对细胞计数，将细胞浓度调整到理想浓度1×106/mL。

2) 10x 标记cDNA的片段，含有barcode信息的凝胶珠子首先与细胞和酶的混合物结合，然后被位于微流体'双十字'连接中的油表面活性剂液滴包裹。液滴非常小，仅能容纳一个凝胶珠子，液滴流到储液器中被收集后，凝胶珠子溶解释放引物序列，逆转录cDNA的片段，并以cDNA 为模板进行PCR 扩增。将每个液滴中含有barcode信息的产物混合，构建测序文库。

3) 建库，首先利用Biorupter 超声破碎仪将cDNA 打断成200~300bp左右的片段，加上测序接头P5 和测序引物R1 等传统二代测序的建库过程，后进行PCR扩增得到DNA 文库。

4) 簇生成和测序，利用Qubit 仪器对文库进行定量，合格的文库被放置到cBot中进行桥式扩增，生成簇后利用Hiseq 或者Miseq测序仪进行测序。原理是每个循环都加入A，T，G，C 4 种荧光基团标记的dNTP，依据AT、GC 配对，对应的dNTP通过1DNA 聚合酶结合到模板DNA 链上，其他未结合的dNTP被洗脱掉，结合的位置释放出荧光信号，被计算机捕捉到并进行相应转换，从而得到该位置的碱基信息。